El conocimiento de los mecanismos patogénicos de la dirofilariosis y de la regulación de la respuesta inmune de los hospedadores es muy limitado. El objetivo de este trabajo es la identificación de proteínas de D. immitis que participan en la estimulación de la respuesta inmune, en perros con infecciones patentes y ocultas.
Ana Oleaga (1), Ricardo Pérez-Sánchez (1), Elaines Pagés (2,3), Cristina Marcos-Atxutegi (2), Fernando Simón (2)1 Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca (IRNASA, CSIC), España.
2 Laboratorio de Parasitología, Universidad de Salamanca, España.
3 University of Puerto Rico, School of Medicine.
Dirofilaria immitis es el agente causante de la dirofilariosis cardiopulmonar canina y felina y de la dirofilariosis pulmonar humana. La mayoría de los perros afectados presentan infecciones patentes con microfilarias circulantes en la sangre periférica (mf+). No obstante, algunos animales desarrollan infecciones ocultas caracterizadas por la ausencia de microfilarias (mf-). En las infecciones mf+ predomina una respuesta inmune de tipo Th2 anti-inflamatoria contra los antígenos del parásito, mientras que las infecciones mf- predomina una respuesta de tipo Th1 pro-inflamatoria contra las bacterias simbiontes del género Wolbachia presentes en D. immitis.
A pesar de estos datos, el conocimiento de los mecanismos patogénicos de la dirofilariosis y de la regulación de la respuesta inmune de los hospedadores es muy limitado. En el contexto de la investigación sobre las relaciones parásito/hospedador en la dirofilariosis canina, el objetivo de este trabajo es la identificación de proteínas de D. immitis que participan en estimulación de la respuesta inmune, en perros con infecciones patentes y ocultas.
El experimento
Se emplearon sueros de perros con dirofilariosis cardiopulmonar mf+ y mf- y un extracto antigénico de vermes adultos de D. immitis (DiSB). Dicho extracto se analizó mediante electroforesis bidimensional (electroforesis 2D), que separa las proteínas por el punto isoeléctrico y el peso molecular, e inmunoblot con los sueros de los perros. Los spots que contenían las proteínas de interés fueron escindidos de los geles y sometidos a análisis mediante espectrometría de masas (MS).
Figura 1. Electroforesis bidimensional del extracto DiSB de vermes adultos de D. immitis. (A, B) Geles teñidos con plata. (C, D) Geles teñidos con el colorante Sypro Ruby. Los círculos y números indican los spots antigénicos analizados.
Figura 2. Western blot 2D en el que se observa los spots antigénicos revelados por un pool de sueros de perros amicrofilarémicos (A, B) y un pool de sueros de perros microfilarémicoss (C, D).Resultados y discusión
El análisis del extracto antigénico DiSB mediante electroforesis 2D reveló unos 400 spots (figura 1) y el análisis mediante inmunoblot (figura 2) mostró que los sueros de perros mf+ reconocen 33 de estos spots, de los que 16 son reconocidos también por los sueros de los perros mf-. El análisis mediante MS permitió identificar 19 proteínas de D. immitis con funciones estructurales, catalíticas, de unión a otras moléculas, inhibición de proteasas o de regulación enzimática (tabla 1).
| Sueros caninos | Proteína | Función molecular | Proceso biológico |
|---|---|---|---|
| mf+, mf- | Actina-1, actina-2, actina-4 | Estructural | - |
| mf- mf+ | Fructosa bisfosfato aldolasa | Catalítica (Aldolasa) | Glicolisis |
| mf+ | Enolasa | Catalítica (Hidratasa) | Glicolisis |
| mf+ | Glucosa fosfato isomerasa | Catalítica (Isomerasa) | Glicolisis |
| mf+ | Triosafosfato isomerasa | Catalítica (Isomerasa) | Glicolisis |
| mf- | Ciclofilina Ovcyp-2 | Catalítica (Isomerasa) | Plegamiento proteico |
| mf+ | Fosfoglicerato quinasa | Catalítica (Quinasa) | Glicolisis |
| mf- | Fumarasa | Catalítica (Liasa) | Procesos metabólicos de carbohidratos y ácidos orgánicos |
| mf- | Fosfoglicerato mutasa isoforma 2 | Catalítica (Mutasa, isomerasa) | Catabolismo de glucosa |
| mf- | Gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa | Catalítica (Oxidoreductasa) | Glicolisis |
| mf- | Hipotética oxidoreductasa FAD-dependiente | Catalítica (Oxidoreductasa) | Transporte de electrones |
| mf- | Oxidoreductasa, familia proteíca aldo/keto reductasa | Catalítica (Oxidoreductasa) | - |
| mf- mf+ | Galectina | Actividad unidora (Unión de azucar) | - |
| mf- mf+ | Proteína de choque térmico 70 | Actividad unidora (Unión de nucleótidos, ATP) | Respuesta al estrés |
| mf- mf+ | Proteína hipotética CBG05397 | Actividad unidora (Unión de proteínas) | - |
| mf- mf+ | Precursor Dit33 inhibidor de pepsina | Inhibición de proteasas | - |
| mf+ | Inhibidor alpha de la disociación del Rab GDP | Regulación enzimática | Transporte de proteínas |
Tabla 1. Función molecular y proceso biológico asignado a las proteínas antigénicas del extracto DiSB, de acuerdo a las bases de datos Gen Ontology y Swiss-Prot/UniProt. mf+ microfilarémicos, mf- amicrofilarémicos.
Estos resultados demuestran que existe reconocimiento antigénico diferencial según que las infecciones sean mf+ o mf-. No se han encontrado antígenos de las bacterias simbiontes Wolbachia. De las moléculas identificadas destacamos la fructosa bisfosfato aldolasa, la galectina y la enolasa. Las dos primeras son responsables de la activación de la respuesta de IgE en humanos expuestos a D. immitis y parecen relacionadas con la supresión de la respuesta Th1 pro-inflamatoria y con mecanismos de supervivencia del parásito. La enolasa es una enzima glicolítica que, además, puede fijar plasminógeno. La activación del plasminógeno por el parásito contribuiría a evitar la formación de coágulos en el entorno de los vermes, lo cual puede ser de vital importancia para un parásito hemático como D. immitis.
Estos resultados muestran la complejidad de las relaciones de D. immitis con sus hospedadores y la necesidad de estudios más extensos para comprender adecuadamente las funciones de las diferentes moléculas parasitarias en dichas relaciones. Este conocimiento permitirá seleccionar racionalmente los antígenos a emplear en futuros estudios para desarrollar vacunas y tests de diagnóstico.
Resumen del trabajo publicado en Molecular and Biochemical Parasitology, 166 (2009): 134-141.
Este artículo es original de Portal
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